Платформа для: iSpring Market, GetCourse, Learme, Антитренинги, Udemy и др.

( A ) Обзор трех этапов платформы обнаружения модифицированных лизинов. Эти шаги повторяются итеративно, чтобы получить вариант интереса, который соответствует критериям выбора. ( B ) Библиотека перетасованных вариантов создается с помощью VersaTile. Построен репозиторий плиток всех модулей (OMP, компоновщики, CBD и EAD). Каждый модуль клонируется в вектор pVTE, фланкируется позиционно-зависимыми тегами (обозначенными разными цветами) и сайтом распознавания BsaI. Сайт рестрикции BsaI расположен в позиционном теге. Все плитки из репозитория затем смешиваются по каждой позиции и объединяются с вектором pVTD для реакции комбинаторной сборки в одной пробирке. После трансформации каждый клон будет иметь разный набор плиток.( C ) Варианты выбирают случайным образом, экспрессируют и анализируют с помощью анализа ингибирования роста в сравнении с панелью из четырех изолятов в трех повторностях. Низкая оптическая плотность указывает на эффект ингибирования роста. ( D) На основе пропорционального обогащения определенных плиток идентифицированными совпадениями по сравнению с секвенированной библиотекой нанопор, извлекаются отношения структура-активность. Эти правила служат входными данными для следующего построения библиотеки с повторным использованием репозитория листов.

Объединение предыдущих знаний для разработки интеллектуальной библиотеки сконструированных лизинов

В ходе предыдущей работы над лизинами, нацеленными на грамотрицательные бактерии, было замечено, что как состав, так и особый порядок комбинированных модулей влияют на антибактериальную активность сконструированных лизинов.Наилучшие результаты были получены при использовании модульных лизинов, содержащих как CBD, так и EAD. Кроме того, промежуточный линкер имел положительный эффект, и наиболее активные варианты имели N-концевой OMP. Поэтому мы разработали библиотеку модульных вариантов с четырьмя позициями и следующей конкретной конфигурацией: OMP-linker-CBD-EAD. Выбранный порядок CBD-EAD напоминает естественную конфигурацию, которая наблюдается в нескольких модульных лизинах фагов, которые инфицируют грамотрицательные бактерии ( 12 ).Мы выбрали для каждой позиции 38 OMP, 2 линкера, 6 CBD и 21 EAD, соответственно (таблица S1).

Выбранные OMP различаются по длине (от 9 до 44 аминокислот), укладке (спиральная, пластинчатая и случайная спираль), катионности, гидрофобности и амфипатичности. Некоторые OMP были разработаны in silico, тогда как другие обладают ранее продемонстрированной активностью в отношении проницаемости внешней мембраны. Мы разработали два гибких линкера разной длины (6 и 14 аминокислот). Мы выбрали пять различных CBD из ранее охарактеризованных модульных лизинов (ΦKZ, EL, OBP, PVP-SE1 и 201phi2-1) ( 17 , 18 ).Все эти CBD напрямую нацелены на пептидогликан с хемотипом A1γ, типичным для грамотрицательных бактерий. Кроме того, мы включили мутагенизированный вариант CBD эндолизина ΦKZ, который больше не способен олигомеризоваться через дисульфидные мостики и который имеет более высокую термостабильность ( 11 ). Мы выбрали 21 различный EAD, происходящий из разнообразия фагов, инфицирующих грамотрицательные виды, и с различными биохимическими специфичностями (лизоцим, трансгликозилаза, амидаза и эндопептидаза). Мы использовали EAD как глобулярных, так и модульных эндолизинов (таблица S1).

VersaTile - эффективный метод быстрого создания больших комбинаторных библиотек лизинов.

VersaTile был разработан для устранения текущих технических ограничений для перетасовки модулей сконструированных лизинов с высокой пропускной способностью. VersaTile следует двухэтапному подходу. Во-первых, создается репозиторий всех модулей, называемых здесь плитками. Во-вторых, из этих плиток можно создать любую сборку направленным или случайным образом (рис.1Б). Следовательно, VersaTile - это метод сборки ДНК, подобный Lego, специально для модульных белков, таких как сконструированные лизины, которые не имеют гомологии ДНК.

Плитка определяется здесь как последовательность кодирования для определенного модуля (например, OMP, компоновщик, CBD или EAD), который сделан совместимым для использования с VersaTile. Следовательно, кодирующая последовательность фланкируется тегами с шестью нуклеотидами и сайтами узнавания BsaI, клонированными в специальный вектор входа (pVTE; фиг. S1). Всего для этого исследования мы создали репозиторий с 67 тайлами (таблица S1).Поскольку дизайн лизина состоит из четырех модулей (OMP-linker-CBD-EAD), тайлы, кодирующие OMP, специально помечены для позиции 1, тайлы, кодирующие линкеры для позиции 2, и т.д. (таблица S2). Расщепление BsaI в позиционных тегах генерирует позиционно-специфичные одноцепочечные выступы, которые соединяются для создания комбинаторных библиотек (циклическое расщепление и лигирование с использованием ДНК-лигазы BsaI и T4 соответственно) в выделенном векторе-приемнике (pVTD; рис. S1). Комбинаторная библиотека была построена со сложностью 9576 (= 38 × 2 × 6 × 21) вариантов путем объединения всех 38 плиток OMP, 2 линкера, 6 CBD и 21 плитки EAD в их соответствующих положениях (таблица S1).В полученных конструкциях соседние модули разделены шестинуклеотидным линкером, кодирующим две свободно выбранные аминокислоты. В этом исследовании использовались только глицин, аланин и серин (таблица S2). Ожидается, что эти гибкие аминокислоты не будут мешать автономному сворачиванию и функционированию модулей. Экспрессия последовательностей OMP-линкер-CBD-EAD в библиотеке управляется промотором Т7.

Стандартный анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование по Сэнгеру случайно выбранных клонов показали правильную и случайную сборку с эффективностью ~ 95%.Для всесторонней оценки представления и случайности отдельных плиток в каждой позиции мы секвенировали 30 435 отдельных вариантов комбинаторной библиотеки с нанопорными технологиями, так как длинные чтения полностью охватывают собранные лизины. Мы извлекли счетчики чтения для каждого отдельного тайла и оценили порядок конкретного тайла, используя синтеническую информацию, содержащуюся в чтениях. Этот контроль качества библиотеки показал, что каждая отдельная плитка хорошо представлена ​​и может быть найдена в ожидаемом месте.Варианты подсчета были распределены логарифмически нормальным образом, и только 99 комбинаций не наблюдались в данных секвенирования без каких-либо конкретных моделей отсутствия (рис. S2).

Хиты идентифицируются посредством параллельного скрининга случайных вариантов на ингибирование роста

Мы реализовали параллельную экспрессию белка и оценку ингибирования роста для скрининга кандидатов-попаданий, присутствующих в комбинаторной библиотеке (рис. 1С). Esherichia coli BL21 (DE3) -RIL клетки трансформировали комбинаторной библиотекой, и случайным образом выбирали 380 клонов.Перетасованные гены лизина экспрессировали параллельно в 96-луночных планшетах. Использование аутоиндукционной среды обеспечивало индукцию экспрессии на одной и той же стадии роста всех клонов. Лизаты всех экспрессированных вариантов были получены путем воздействия на бактерии паров хлороформа. Полный лизис клеток подтверждался отсутствием жизнеспособных бактерий после нанесения на лизаты пятен.

Мы протестировали эти очищенные лизаты на ингибирование роста четырех различных штаммов A. baumannii с множественной лекарственной устойчивостью [10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл].Семь вариантов (~ 2%) показали полное ингибирование роста по крайней мере одного штамма (таблица 1). В частности, вариант 1D9 полностью ингибировал все протестированных штаммов A. baumannii , тогда как вариант 1G7 был высокоактивен против трех штаммов. Остальные варианты полностью подавляли два штамма (1B11 и 1h5) или один штамм (1D1, 1A10 и 1h4) соответственно. A. baumannii NCTC 13423 оказался наиболее чувствительным штаммом, тогда как RUH 134 полностью ингибировался только одним вариантом.Таким образом, штаммы с множественной лекарственной устойчивостью демонстрировали переменную чувствительность. Пятна культур клеток после 24-часового воздействия этих вариантов подтвердили их бактерицидный эффект. Все варианты также проявляли муралитическую активность (таблица 1), но не наблюдали корреляции между муралитической и ингибирующей рост активностью.

Модульная композиция, ингибирующая рост активности против четырех множественной лекарственной устойчивости A.baumannii , а муралитическая активность дана для вариантов, которые полностью подавляли рост по крайней мере одного штамма. Варианты ранжированы по эффекту ингибирования роста. Полная аннотация модулей доступна в таблице S1. Корреляции между активностью ингибирования роста и ферментативной активностью не наблюдается.

Активные сконструированные лизины показывают консервативные отношения структура-активность

Состав плитки из семи совпадений был определен путем секвенирования для поиска взаимосвязей структура-активность (Таблица 1).Некоторые плитки были более распространены в позиции 1 (OMP) и позиции 3 (CBD) (рис. 1D). В частности, четыре из семи активных вариантов содержат связанный с цекропином пептид (3 × OMP7; 1 × OMP11) в положении 1. Связанные с цекропином пептиды содержат консервативную α-спираль, прерванную шарниром (рис. S3) ( 19 ), что может быть признаком положительного эффекта, связанного с этим типом пептидов. Из шести возможных CBD присутствовали четыре. CBD2 и CBD6 присутствовали в двух наиболее активных попаданиях, соответственно, и также наиболее распространены (трехкратное и двукратное соответственно).Кроме того, CBD6 представляет собой мутагенизированное производное CBD1 лизина KZ144 ( 18 ), и ранее было показано, что он улучшает стабильность и активность в Art-175 ( 11 ). Не наблюдалось обогащения специфическим линкером или EAD.

Итерационный комбинаторный экран библиотеки приводит к увеличению соотношения сконструированных лизинов с улучшенной и более широкой эффективностью

На основе предполагаемых взаимосвязей структура-активность для позиций 1 и 3, вторая специализированная библиотека со сложностью 336 (4 × 2 × 2 × 21) вариантов был построен с использованием VersaTile, повторно используя плитки из репозитория (таблица S3).Для позиции 1 количество OMP было уменьшено с 38 до 4, включая только пептиды, связанные с цекропином (OMP6, OMP7, OMP10 и OMP11). Для позиции 3 были сохранены CBD2 и CBD6. Ряд из 188 клонов были отобраны случайным образом, экспрессированы и проанализированы на одной и той же тестовой панели штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Медианный эффект ингибирования роста был аналогичным для обеих библиотек, но распределение эффектов ингибирования роста сконструированных лизинов из второй библиотеки было стабильно более широким по сравнению с вариантами из первой библиотеки, как с более низкими, так и с более высокими вариантами (рис. 2А). При тех же критериях отбора, что и в первом цикле, 40 вариантов показали полную ингибирующую активность против по крайней мере одного штамма, что значительно увеличило процент попаданий с 2 ​​до 21% (40 из 188) ( P <0,001). Это очевидное увеличение доли активных сконструированных лизинов также сопровождается увеличением количества вариантов, которые полностью ингибировали четыре штамма, за счет вариантов, которые полностью ингибировали только один штамм (фиг. 2B и таблица S4).Оба наблюдения подтверждают, что одна или обе реализованные связи структура-активность эффективно способствуют более высокому проценту попаданий.

( A ) График распределения активности ингибирования роста 380 вариантов (первая библиотека: синий) и 188 вариантов (вторая библиотека: зеленый) против четырех эпидемиологических штаммов A. baumannii . Обе библиотеки имеют одинаковое медианное значение, но вторая библиотека последовательно демонстрирует более широкое распределение с увеличенным числом как превосходных, так и низших вариантов. ( B ) Процент попаданий, подавляющих четыре штамма A. baumannii , увеличивается с 2 до 21%. Хиты второй библиотеки демонстрируют более широкую активность против протестированных штаммов A. baumannii , при этом более половины из них ингибируют все штаммы.

Был определен состав всех 40 совпадений (таблица S4). OMP7, то есть цекропин A из Aedes aegypti , является наиболее распространенным OMP с 31 из 40 случаев и присутствует исключительно в хитах с самой широкой активностью.Остальные хиты имеют OMP11, то есть саркотоксин IA из Sarcophaga peregrine , на первом месте. Два других связанных с цекропином OMP, которые были включены во вторую библиотеку, не попали в список попаданий. Линкер 1 (15 из 40) или линкер 2 (25 из 40) оба были хорошо представлены, тогда как CBD6 был чрезмерно представлен (32 из 40) по сравнению с CBD2 (8 из 40). Было идентифицировано шестнадцать различных EAD (из 21 EAD, включенных во вторую библиотеку), что демонстрирует гибкость в этой позиции. Тем не менее, EAD4 был самым распространенным - 6 из 40 случаев.

Идентификация свинцового варианта, активного против

Наиболее активные варианты (24 из 40) против трех или четырех штаммов A. baumannii (таблица S4) не были показаны для проверки бактерицидной активности в более строгих условиях (50% сыворотки крови человека), чтобы лучше имитировать физиологические условия человека. Наиболее чувствительные и устойчивые штаммы A. baumannii (NCTC 13423 и RUH 134 соответственно) были обнаружены после 24-часового воздействия различных вариантов.Пять вариантов (21%) показали полное отсутствие выживших клеток в сыворотке крови человека, при этом один из них (1D10) полностью убил оба штамма (таблица S5). Этот сконструированный лизин (OMP7 – линкер 1 – CBD6 – EAD20) был окончательно выбран в качестве ведущего варианта.

Крупномасштабная экспрессия варианта свинца дала 22 мг на литр объема экспрессии после очистки с помощью аффинной хроматографии с никелем. Значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) варианта свинца против четырех эпидемиологических A.baumannii (таблица S6), разнообразный набор из 27 патогенных штаммов A. baumannii и 22 видов Acinetobacter , включая 34 изолята клинических ожоговых ран (таблица S7), варьировался от 4 до 24 мкг / мл (11,8 ± 5,2 мкг). / мл) ( 20 ). Добавление 0,2 мМ ЭДТА, который действует как хелатор двухвалентных катионов, присутствующих на внешней мембране, дополнительно снижает значения MIC до 2-20 мкг / мл (4,4 ± 3,6 мкг / мл). Количество бактерий четырех протестированных штаммов было уменьшено как минимум на 5 log (рис.3). Вариант свинца показал штамм-зависимую гибель в 90% сыворотке крови человека. При дозе 10 × МИК штамм NCTC 13423 был наиболее восприимчивым штаммом, достигнув 4,5-log уменьшения количества клеток через 30 мин, тогда как количество клеток штаммов LUH 5875, RUH 875 и RUH 134 уменьшилось между 2,4 и 2,7 лога соответственно. Включение 0,2 мМ ЭДТА немного увеличило логарифмическое сокращение клеток до 2,7-3,1 log соответственно ( P <0,05) (фиг. 3).

Используемая концентрация варианта свинца составляет 1 × МИК в буфере и 10 × МИК в сыворотке человека в присутствии или в отсутствие 0,2 мМ ЭДТА. Все эксперименты в буфере достигли предела обнаружения анализа, а также все эксперименты с A. baumannii NCTC 13423. Каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. * P <0,05, тест Стьюдента t ; *** P <0.001, Студенческий тест t .

Вариант свинца замедляет рост бактерий и образование биопленки в ex vivo модели ожоговой раны эксплантата кожи свиньи.

Для моделирования роста бактерий и образования биопленки на ожоговых ранах была создана модель эксплантата кожи свиньи. Стандартизированное ложе ожоговой раны создавали на небольших кусочках свиной кожи, после чего инфицировали A. baumannii . После бактериальной адгезии ложе раны опрыскивали 50 мкг лизина. В целом, ведущий вариант может контролировать рост бактерий и образование биопленок у всех тестируемых штаммов после однократной обработки (рис.4А). Это ингибирование привело к снижению на 2,4-3,8 log единиц в модели ожоговой раны через 8 часов после обработки по сравнению с необработанным контролем. Это снижение было улучшено при использовании последовательных доз (через 2 и 4 часа после первого лечения). Наилучшие результаты были получены после применения тройной дозы (снижение на 4,8 до 5,1 логарифмических единиц через 8 часов после лечения). Антибактериальная активность свинцового варианта проявляется в течение первых 5 мин после нанесения белка со снижением на 3 и 2 log единицы по сравнению с A.baumannii RUH 134 и NCTC 13423 соответственно (рис. 4Б). A. baumannii RUH 134 стал наиболее чувствительным штаммом в этой модели инфекции ex vivo. Подобные результаты были получены в случае местной раневой инфекции без ожога (рис. S4).

( A ) Данные представляют собой логарифм КОЕ на эксплант после обработки либо однократной дозой ведущего варианта (50 мкг) в момент времени 0 часов, либо двойной дозой белка (через 2 часа после первой дозы), либо тройной дозой. доза (через 2 и 4 часа после первой обработки).Контроль представляет собой количество бактерий без обработки белком. ( B ) Столбцы (синяя полоса: контроль, зеленая полоса: обработанная 1D10) представляют логарифм КОЕ на эксплант после однократной дозы белка (50 мкг; время 0 мин) в течение короткого периода времени (60 мин). . Значения соответствуют среднему значению ± стандартное отклонение для четырех повторов. Звездочки указывают статистические различия между контрольным и обработанным образцами ( P <0,05, тест Стьюдента t ). Предел обнаружения бактерий составляет 5 КОЕ на эксплант.

ОБСУЖДЕНИЕ

Необходимы новые платформы для открытия антимикробных препаратов, чтобы пополнить портфель антибиотиков в ответ на быстрое появление бактерий с множественной и устойчивостью к пандемиям. В то время как традиционная платформа Ваксмана исчерпала себя и страдает от повторного открытия, были разработаны альтернативные платформы для идентификации антимикробных (сконструированных) пептидов или антибиотиков из некультивируемых организмов ( 21 - 25 ). Недавний клинический прогресс до фазы 2 испытаний продемонстрировал многообещающие перспективы лизинов как широкого нового класса антибактериальных средств.Лизины могут быть идентифицированы против каждого патогена. Кроме того, они дополнительно разрабатываются, чтобы усилить их свойства для использования в качестве антибактериальных средств или сделать их активными против грамотрицательных бактерий ( 7 ). Однако до сих пор отсутствует эффективный высокопроизводительный подход к созданию и идентификации наиболее многообещающего модифицированного лизина. Представленный здесь подход сочетает в себе высокопроизводительную комбинаторную перетасовку модулей лизина с помощью VersaTile с параллельным и итеративным антибактериальным скринингом.Этот подход устанавливает непрерывный процесс разработки модифицированных лизинов, чтобы насытить конвейер новыми потенциальными кандидатами для доклинической оценки.

Разработка и реализация VersaTile позволяет генерировать большие комбинаторные библиотеки перетасованных сконструированных лизинов. В общем, метод, который позволял бы полную комбинаторную перетасовку независимым от гомологии способом, начиная с неограниченного числа родительских последовательностей, отсутствовал ( 15 ). Методом выбора для создания сконструированных лизинов уже давно является традиционное ограничение / лигирование.Этот подход является адекватным, но становится все более громоздким и трудоемким, когда необходимо объединить больше модулей или когда необходимо большое количество комбинаторно перетасованных вариантов ( 15 ). Самые большие зарегистрированные библиотеки сконструированных лизинов с использованием этих методов насчитывают 49, 126 и 174 варианта ( 9 , 10 , 12 ). Самые старые и наиболее часто используемые методы комбинаторной перетасовки основаны на гомологичной рекомбинации [например, перетасовке ДНК на основе дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)], но не применимы для рекомбинации четко определенных негомологичных строительных блоков, таких как OMP, линкеры, CBD. , и EAD.Недавно были разработаны методы, не зависящие от гомологии, такие как ITCHY, SCRATCY, SHIPREC, SCOPE, SISDC и USERec ( 26 - 32 ), но лишь частично восполняют этот пробел, поскольку все они имеют свои специфические недостатки (например , комбинация только двух модулей, очень трудоемкая из-за нескольких PCR и невозможности высокопроизводительного комбинаторного перетасовки). VersaTile позволяет нам перетасовать неродственные последовательности ДНК рациональным или комбинаторным образом, используя врожденную способность рестрикционного фермента типа IIS направленно вырезать его сайт узнавания с возможностью свободного выбора сайта рестрикции, как в других методах, таких как Golden Gate перетасовка ( 33 ). В VersaTile эти сайты рестрикции встроены в теги с шестью нуклеотидами, которые кодируют гибкие аминокислоты, которые взаимодействуют с двумя модулями и, как ожидается, не будут мешать автономному сворачиванию и функционированию модулей. На основе предыдущих работ по разработке лизина в качестве небольших аминокислот были выбраны глицин, серин и аланин.

После создания репозитория тайлов первая библиотека из примерно 10 000 вариантов может быть создана за один день. Первоначальная частота совпадений 2% и обогащенные OMP и CBD обеспечили необходимые входные данные для создания второй библиотеки с повторным использованием плиток из существующего репозитория плиток.Скрининг этой второй библиотеки показал увеличение доли активных вариантов до более чем 21%, подтверждая положительный вклад (одного) реализованных правил проектирования. Наиболее активные сконструированные лизины из второй библиотеки были отобраны для тестирования их активности in vitro в сыворотке крови человека, имитируя физиологические условия. Это привело к идентификации 1D10, который снижает количество бактериальных клеток до 4,5 логарифмических единиц за 30 мин в сыворотке крови человека. Идентифицированный вариант обладает широкой ингибирующей активностью против видов Acinetobacter и предотвращает рост бактерий и развитие биопленок на модели кожной (ожоговой) раны свиньи ex vivo с A.baumannii.

На сегодняшний день другие (сконструированные) лизины или пептиды, полученные из лизинов, были использованы против A. baumannii , однако они либо не активны в ранах или сыворотке человека, либо не были протестированы ( 7 , 34 - 37 ). Некоторые нативные эндолизины против Pseudomonas aeruginosa активны в условиях низкого содержания сыворотки ( 38 ). Кроме того, лизоцин PyS2-GN4, гибрид пиоцина узкого спектра и домена лизина, активен в сыворотке человека с 4-логарифмическим снижением через 12 часов ( 39 ).Хотя вариант 1D10 появился в качестве ведущего кандидата из библиотеки с четко определенными правилами проектирования, состав последнего ведущего варианта был неожиданным. Хотя ранее было продемонстрировано, что его OMP активен против видов A. baumannii ( 40 ), его EAD происходит из gp16 фага BcepC6B. Последний представляет собой VAPGH, который локально разрушает слой пептидогликана во время инфекции и имеет ограниченную ферментативную активность по сравнению с фаговыми эндолизинами ( 41 ). Тем не менее, успех VAPGH можно рационально объяснить, поскольку VAPGH действует естественным образом извне и часто устойчив к более суровым внешним условиям (pH, температура, присутствие солей или компонентов комплемента, как в сыворотке крови человека) ( 42 - 45 ).

Поскольку мы проводили скрининг на ингибирующую рост активность очищенных лизатов, наблюдаемые эффекты ингибирования роста являются результатом комбинированного эффекта внутренней антибактериальной активности и выхода экспрессии в лизате. Из-за значительного разброса последовательностей среди различных модульных вариантов выход экспрессии также варьируется (рис. S5). Варианты, которые хорошо работают по обоим параметрам, окажутся на вершине рейтинга. В противном случае это также означает, что вариант с низким выходом экспрессии, но высокой внутренней активностью может оцениваться так же хорошо, как вариант с высоким выходом экспрессии, но с низкой внутренней активностью.В конечном итоге было показано, что свинцовый вариант 1D10 сочетает высокий выход экспрессии (22 мг / л) и высокую антибактериальную активность, в том числе в сыворотке крови человека. Обе функции удобны для доклинического анализа и позволят снизить возможные затраты на производство и очистку. Обратите внимание, что муралитическая активность не является показателем активности ингибирования роста (таблица 1). В то время как муралитическая активность в основном определяется комбинацией CBD-EAD, активность ингибирования роста также зависит от эффективности OMP для переноса фрагмента лизина через внешнюю мембрану.Кроме того, OMP также может частично вносить вклад в ингибирующую активность, как наблюдалось ранее ( 11 ).

Представленный подход носит общий характер и потенциально может быть применен к любой бактериальной мишени. Кроме того, можно исследовать каждую возможную конфигурацию (например, удвоение OMP или EAD, обратный порядок CBD / EAD, C- вместо N-концевого положения OMP и вариации линкера между CBD и EAD). Кроме того, VersaTile можно использовать для создания библиотек ДНК, которые кодируют варианты любого модульного белка, расширяя набор инструментов для белковой инженерии множеством возможностей.В то время как VersaTile устранил серьезное техническое препятствие в разработке лизинов, возникло следующее препятствие в производительности последующих анализов. Учитывая отсутствие методов для анализа всех ~ 10 000 вариантов, сокращенная траектория прослеживалась через пространство последовательностей, включающее все перемешанные варианты. Попадания с первого экрана случайно выбранных клонов направили нас к подгруппе пространства последовательностей, где был проведен более плотный поиск со второй библиотекой, чтобы в итоге оказаться как можно ближе к лучшему варианту без чрезмерных усилий по скринингу. Последовательности случайно выбранных клонов были раскрыты только после выбора совпадений с последующим извлечением взаимосвязей структура-активность между наблюдаемыми данными антибактериальной активности и последовательностями совпадений. В сочетании с технологией VersaTile можно использовать другую стратегию скрининга. Путем выполнения многочисленных параллельных реакций рациональной сборки, которые применялись при открытии лекарств с помощью комбинаторной химии, может быть создана комбинаторная библиотека с известным систематическим изменением для каждой позиции.На основе параллельного анализа антибактериальной активности этих вариантов, проведенного в данном исследовании, положительный или отрицательный вклад каждой плитки можно количественно рассчитать на основе известных последовательностей каждого варианта ( 46 - 47 ) . Хотя это требует дополнительных экспериментальных работ по конструированию библиотек и скринингу библиотек, варианты с еще более улучшенной антибактериальной активностью могут быть идентифицированы на основе этих количественных соотношений последовательность-функция. В конце концов, метод скрининга с пропускной способностью, которая может соответствовать сложности библиотеки, созданной VersaTile, позволит еще больше использовать преимущества VersaTile. Можно представить себе гораздо большие библиотеки. Каждую дополнительную плитку, которая будет добавлена ​​в репозиторий, можно объединить со всеми существующими плитками, например, если добавить одну плитку линкера, можно построить еще приблизительно 5000 сконструированных лизинов. Также могут быть разработаны другие конфигурации с другим порядком модулей, что быстро увеличивает общее количество вариантов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и питательная среда

Все штаммы Acinetobacter , использованные в этом исследовании, и их источник показаны в таблице S7. Первоначальный набор из четырех штаммов включает контрольные эпидемиологические клоны Европейского Союза (ЕС), которые были обнаружены во всем мире и также называются всемирными клонами от I до III [I: RUH 875, II: RUH 134 и III: LUH 5875 ( 20 )]. Четвертый используемый штамм - это так называемый Иракибактер («штамм Т»: NCTC 13423, изолятор поля боя из жертв иракского конфликта) ( 48 ).Для хранения плазмиды и экспрессии белка использовали E.coli TOP10 и BL21 (DE3) -RIL (Agilent Technologies, Бельгия) соответственно. Все штаммы Acinetobacter (30 ° C) и E. coli (37 ° C) обычно выращивали в бульоне LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1% NaCl) при встряхивании (200 об / мин) или на LB с добавлением 1,5% агара. Для правильного отбора клонов E. coli в LB добавляли ампициллин (100 мкг / мл), канамицин (50 мкг / мл) и 5% (мас. / Об.) Сахарозу.

VersaTile: приготовление плиток

В зависимости от длины кодирующей последовательности плитку конструировали либо с помощью ПЦР с праймерами с расширенными 5'-последовательностями, либо с помощью генного синтеза [> 100 нуклеотидов (нуклеотидов)], либо генерировали гибридизацией кассеты праймеров (< 100 нт). Каждый праймер (Integrated DNA Technologies, Лёвен, Бельгия) содержал следующие необходимые части (перечисленные, начиная с кодирующей последовательности и далее): отдельный позиционный тег, сайт узнавания BsaI (для создания библиотеки) и сайт рестрикции и узнавания Sap I. (для строительства плитки).Все ферменты были от Thermo Fisher Scientific (Бельгия), если не указано иное. Для кассетной гибридизации праймеры смешивали в равных соотношениях (5 мкМ) и инкубировали при 95 ° C (5 мин) с последующим постепенным охлаждением до комнатной температуры (20 ° C). Затем одноцепочечные выступы заполняли ДНК-полимеразой Pfu (2,5 ед., 72 ° C, 10 мин). Последовательности (> 100 нуклеотидов) амплифицировали с помощью ДНК-полимеразы Pfu (2,5 ед.), Следуя инструкциям производителя, со 100 мкг геномной ДНК фага в качестве матрицы.

Затем кассеты праймеров и ампликоны лигировали в сайт sapI pVTE, используя следующий протокол: 100 нг pVTE, 50 нг кассеты ампликона / праймера, 2 мкл буфера ДНК-лигазы Т4, 15 Ед Т4. ДНК-лигаза и 10 ЕД Sap I в общем объеме 20 мкл. Химически компетентные клетки E.coli TOP10 трансформировали всей смесью для лигирования и высевали на 1,5% агар LB с добавлением ампициллина (100 мкг / мл) и 5% (мас. / Об.) Сахарозы. Новые плитки подтверждали секвенированием по Сэнгеру (LGC Genomics, Германия), и для каждой плитки готовили запасы 50 нг / мкл.

VersaTile: Подготовка комбинаторных библиотек

Для каждой позиции была приготовлена ​​смесь плитки, взяв 1 мкл 50 нг / мкл каждой выбранной плитки. Это повторяется отдельно для всех позиций 2, 3 и 4. Затем из каждой смеси плиток для определенного положения брали 1 мкл и смешивали с 1 мкл из других смесей плиток, ограниченных положениями 2, 3 и 4. Реакцию перетасовки VersaTile проводили с использованием следующего протокола: 1 мкл pVTD ( 100 нг / мкл), смесь плитки (4 мкл), 1 мкл BsaI (10 ед / мкл), 3 мкл ДНК-лигазы Т4 (1 ед / мкл) и 2 мкл буфера лигирования ДНК Т4 в общей реакции объем 20 мкл.Смесь инкубировали в термоциклере, используя следующую программу: (i) 2 мин при 37 ° C и (ii) 3 мин при 16 ° C; шаги 1 и 2 повторяются 50 раз, затем 5 минут при 50 ° C и, наконец, 5 минут при 80 ° C. Химически компетентные клетки E.coli BL21 (DE3) -RIL трансформировали всей смесью для лигирования и высевали на 1,5% агар LB с добавлением канамицина (50 мкг / мл) и 5% (мас. / Об.) Сахарозы.

Секвенирование нанопор и анализ последовательности комбинаторной библиотеки

Эта библиотека была секвенирована с использованием секвенатора MinION [Oxford Nanopore Technologies (ONT), Великобритания].Первоначально препарат плазмидной ДНК комбинаторной библиотеки был линеаризован с помощью рестрикционного фермента Ecl136ii в сайте, обнаруженном выше сайта клонирования и отсутствующем во всех конструкциях, кроме одной, в положении 4 (следовательно, не влияло на возможности обнаружения). Затем была приготовлена ​​ДНК с использованием метода одномерного (1D) лигирования ONT, метода без ПЦР, который сохраняет целостность молекул ДНК. Полученную библиотеку секвенировали на секвенаторе MinION, оборудованном R9.4.1 проточная кювета на 48 часов. Вызов оснований выполнялся для данных с использованием ONT Albacore v2.3.4, и полученные считывания были строго отфильтрованы для сопоставления (BWA-MEM) по всей их длине с исходным вектором pVTSD, за исключением области, замещенной продуктом реакции VersaTile ( 49 ). Впоследствии мы проанализировали эти замещенные области, используя локальное выравнивание с помощью инструмента иглы EMBOSS, чтобы проверить как порядок, так и тип плиток, из которых состоят конструкции ( 50 ).

Параллельная экспрессия белка и получение лизата.

Ночные культуры получали инокуляцией отдельных колоний в лунки 96-луночного планшета, каждая из которых была заполнена 500 мкл LB с канамицином (50 мкг / мл). Планшет покрывали лентой, обеспечивающей воздухообмен (Brand GmbH, Германия), и встряхивали (900 об / мин) при 37 ° C в течение 18 часов. Небольшой объем (15 мкл) из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет, заполненный 500 мкл среды для автоиндукции на лунку ( 51 ).Эти планшеты инкубировали в течение 5 часов при 37 ° C (900 об / мин). Затем культуры инкубировали при 16 ° C в течение 48 часов. Клетки собирали центрифугированием (3200, г, , 30 мин, 4 ° C). Осадки, содержащие клетки, дополнительно лизировали путем воздействия паров хлороформа над фильтром, насыщенным хлороформом, в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого планшет с глубокими лунками переворачивали для выпаривания остаточного хлороформа. Каждый лизат суспендировали в 500 мкл 20 мМ HEPES-NaOH, 150 мМ NaCl (pH 7.4) и 1 ед. ДНКазы I с последующей инкубацией при 30 ° C при 100 об / мин в течение 1 часа. После полного ресуспендирования гранул 5 мкл наносят на чашку с агаром LB для подтверждения полного лизиса бактерий. Затем лизаты очищали центрифугированием (3200 g , 45 мин, 4 ° C) и хранили при 4 ° C.

Ингибирование роста и муралитический анализ

Культуры Acinetobacter выращивали в бульоне Мюллера-Хинтона (MH) (Becton Dickinson, Бельгия) в течение 18 часов при 30 ° C. Затем культуры разводили в бульоне 2 × MH до OD _{625 нм} (оптическая плотность при 625 нм) = 0.1 (~ 5 × 10 ⁸ КОЕ / мл). Из этой клеточной суспензии 50 мкл засевают в лунки микротитрационного планшета, а также 50 мкл очищенных лизатов. Мутность измеряется при 655 нм через 18 и 24 часа. Капли 5 мкл культур наносили на чашки с агаром LB для анализа бактерицидной активности. Для тестирования активности в сыворотке человека использовали тот же протокол, за исключением того, что культуры разводили в 100% сыворотке человека (MP Biomedicals, Бельгия). Через 24 часа суспензии разбавляли 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7.4) и высыпали на чашки с агаром LB.

Субстрат для муралитического анализа получали, как описано ранее ( 52 ). Вкратце, P. aeruginosa PAO1 выращивают в течение ночи при 37 ° C в орбитальном шейкере. На следующий день свежие LB инокулируют ночной культурой и культуру выращивают до OD _{600 нм} = 0,6. Культуру центрифугируют и ресуспендируют в буфере, насыщенном хлороформом [0,05 М трис-HCl (pH 7,7) и хлороформ]. Ресуспендированный раствор осторожно встряхивают ровно 45 мин.Раствор дважды промывают фосфатно-солевым буфером (PBS; pH 7,4) (OD _{600 нм} = ± 1,5). Объем 270 мкл субстрата смешивают с 30 мкл очищенного лизата. Поглощение (OD _{, 600 нм,} ) измеряют каждые 30 с в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем муралитическую активность рассчитывали с использованием стандартизированного метода расчета ( 52 ).

Крупномасштабная экспрессия и очистка белка

Рекомбинантную экспрессию выбранных хитов выполняли, как описано ранее ( 11 ).Свежие клетки [ E.coli BL21 (DE3) -RIL] инокулировали в 0,5 литра среды LB и выращивали при 37 ° C до OD _{600 нм} = 0,5-0,6. Экспрессию индуцировали 1 мМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозидом (IPTG) при 16 ° C в течение 18 часов. Клетки E. coli лизировали в 20 мл буфера для лизиса [20 мМ NaH ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ , 0,5 М NaCl и 50 мМ имидазол (pH 7,4)] замораживанием. -оттаивание и обработка ультразвуком (Q125, Qsonica) на льду. Лизаты очищали (16000 г ; 20 мин) и фильтровали (поливинилидендифторид, 0.Размер пор 22 мкм; Новолаб, Бельгия). Растворимый белок очищали на колонках His GraviTrap (GE Healthcare, Бельгия) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенный лизин подвергали диализу против 20 мМ HEPES-NaOH и 500 мМ NaCl (pH 7,4), а затем против 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4), используя Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (Thermo Fisher Scientific, Бельгия). ). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически.

Time-kill assay

Стационарную фазу культуры соответствующего штамма разводили (1:10) и инкубировали при 30 ° C (200 об / мин) до средней экспоненциальной фазы (OD _{600 нм} = 0.6). Суспензию клеток трижды промывали 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4) и разбавляли в 100 раз 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4) (~ 10 ⁶ КОЕ / мл). . Клеточную суспензию 100 мкл инкубировали при комнатной температуре с 50 мкл диализованного лизина и 50 мкл 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4) с / без 0,2 мМ EDTA. Конечную концентрацию ведущего варианта (1D10) доводили для каждого штамма до 1 × MIC. Через 30 мин разведения клеток высевали в трех экземплярах (30 ° C).Антибактериальная активность определялась количественно как относительный уровень инактивации в логарифмических единицах [log ₁₀ ( N ₀ / N _i ), с N ₀ = исходное количество необработанных клеток и N _i = количество остаточных клеток после обработки]. Анализы «убивающего по времени» в сыворотке проводили аналогичным образом. Объемы были скорректированы для достижения 90% сыворотки крови человека, и 10 × MIC использовали вместо 1 × MIC в качестве конечной концентрации варианта свинца (1D10).

Анализ MIC

Представляющие интерес бактерии выращивали в течение ночи в бульоне MH (30 ° C, 200 об / мин). Затем ночную культуру разбавляли 1:10 и выращивали до OD _{600 нм} = 0,6 с последующим 5000-кратным разведением в бульоне MH (~ 2 × 10 ⁵ КОЕ / мл). Диализованный лизин [20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4)] добавляли к суспензии клеток с конечной концентрацией в диапазоне от 0 до 20 мкг / мл с шагом 2 мкг / мл, с 0,2 мМ EDTA и без него. Бланк и контроли включали интересующую бактерию без белка и без ЭДТА и неинокулированный бульон.Планшет инкубировали в течение 18 часов при 30 ° C, и MIC определяли как самую низкую концентрацию, которая давала полное ингибирование роста.

Модель эксплантата кожи свиньи (ожоговая) раневая инфекция

Чтобы проверить способность свинцового варианта (1D10) уменьшать развитие бактериальной биопленки, мы использовали модель раневой инфекции, описанную ранее с некоторыми модификациями ( 53 ). Вкратце, свиная кожа была получена в Центре минимально инвазивной хирургии Хесус Усон (Касерес, Испания).Кожу осторожно сбривали ножницами и бритвами. Кроме того, кожу дополнительно очищали 70% -ным изопропиловым спиртом и давали высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем эксплантаты кожи были получены путем разрезания 1 см × 1 см. Ложе раны было создано, как описано ранее ( 51 ), с использованием ручного высокоскоростного сверла с высокоскоростной круглой фрезой диаметром 4,8 мм (Dremel # 192). Это постоянно образует центральное «ложе раны» диаметром 4,8 мм и глубиной 1 мм. С другой стороны, для создания ожоговой раны нужен инструмент из нержавеющей стали с плоским концом 4.Диаметр 8 мм. Для создания «ложа ожоговой раны» конец инструмента обжигали в течение 30 с, а затем штамповали на кожный эксплантат на 2 с. Немедленно все кожные эксплантаты с раной или ожоговой раной стерилизовали погружением в 70% этанол с последующей промывкой в ​​физиологическом растворе (0,9% NaCl, pH 5,5) и, наконец, стерилизацией ультрафиолетом в течение 10 мин. Затем стерильные эксплантаты переносили в 24-луночные планшеты, заполненные 1 мл физиологического раствора (0,9% NaCl, pH 5.5) с добавлением 0,5% агара для имитации состояния человеческого тела.

Для приготовления бактериального инокулята штаммов A. baumannii выращивали в встряхиваемом бульоне LB при 30 ° C. Затем бактерии разбавляли до конечной концентрации 10 ⁶ КОЕ / мл в 20 мМ HEPES-NaOH и 150 мМ NaCl (pH 7,4). Затем 10 мкл этого разведения добавляли к ране или ложе ожоговой раны (~ 10 ⁴ КОЕ на эксплант) в двух экземплярах (четыре экспланта на штамм на точку отбора проб). Затем бактериям давали прилипнуть, инкубируя 15 мин при комнатной температуре.Наконец, на кожу распыляли 100 мкл диализованного лизина (конечная концентрация 50 мкг на эксплант). Образцы, соответствующие моменту времени 0, обрабатывали сразу после распыления. Остальные образцы инкубировали при 37 ° C с 0,5% CO ₂ . Кроме того, некоторые образцы обрабатывали белком дважды (обработка двойной дозой, через 2 часа после первой обработки) или трижды (через 4 часа после первой обработки). HEPES-NaOH (20 мМ) и NaCl (150 мМ, pH 7,4) использовали в качестве контроля нелеченой инфекции.В каждый момент времени отбирали образцы и добавляли 1,5 мкл протеиназы К для инактивации белка. Каждый эксплант в условиях асептики переносили в мешок для стоматологии (BagPage, BagSystem, Interscience, St-Nom-la-Breteche, Франция), содержащий 5 мл PBS (pH 7,4), и гомогенизировали в течение 90 с в стоматологическом мешке (модель 80, Seward Medical, Лондон, Великобритания). После гомогенизации разведения высевали на чашки с агаром LB. Планшеты инкубировали при 30 ° C в течение 16 часов. Каждая временная точка состоит из двух биологических повторений и двух технических повторений с использованием двух разных эксплантатов кожи.

Гомологическое моделирование OMP, присутствующих в активных сконструированных лизинах в первом раунде скрининга

Для прогнозирования трехмерной структуры OMP, которые присутствовали в активных сконструированных лизинах после первого раунда скрининга, мы использовали Iterative Threading ASSEmbly Refinement с стандартные параметры ( 19 ).

Статистический анализ

Данные, полученные в тестах активности in vitro (анализы с ограничением по времени и анализы MIC), выражали как среднее ± стандартное отклонение для трех повторов.Для модели ex vivo раневой и ожоговой инфекции данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для четырех повторов. Во всех случаях тест Стьюдента t использовали для сравнения различий между обработанными и необработанными бактериальными культурами на уровне значимости P <0,05 (программа SPSS-PC + 11.0, Чикаго, Иллинойс, США). Хи-квадрат Пирсона с точным критерием Фишера использовался для сравнения разницы в частоте совпадений между первой и повторной комбинаторной библиотекой на уровне значимости P <0.001 (программа SPSS-PC + 11.0, Чикаго, Иллинойс, США). Эмпирическое распределение тайлов, полученных с помощью секвенирования нанопор, было проанализировано с помощью пакета fitdistrplus (X) ( 54 ) с использованием функции chisq. test, доступной в статистической среде R ( 55 ), для сравнения с моделированным логарифмически нормальным распределением. ( P > 0,05).

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечное использование составляет , а не для коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно процитирована.

ССЫЛКИ И ПРИМЕЧАНИЯ

1. ↵
2. ↵
3. ↵
4. ↵
5. ↵
6. ↵
7. ↵
8. ↵
9. ↵
10. ↵
11. ↵
13. 900
14. ↵
15. ↵
16. ↵
17. ↵
18. ↵
19. ↵
23. ↵
24. ↵

    AK Udit, JJ Silberg, V. Sieber, в Создание библиотеки направленной эволюции: методы и протоколы (Humana Press, 2003), стр. 153–163.

30. ↵
31. ↵
32. ↵
35. ↵
36. ↵
37. ↵
38. ↵
39. ↵
40. ↵
44. ↵
45. ↵
46. ↵

    NJ Saez, R. Vincentelli, Высокопроизводительный скрининг экспрессии и очистка рекомбинантных белков в E. coli, в Structural Genomics. Методы молекулярной биологии , Ю.Чен, Эд. (Humana Press, 2014), т. 1091.

47. ↵
48. ↵
49. ↵
50. ↵

Благодарности: Мы благодарим J.-P. Pirnay и L.V. Peixe за предоставление штаммов Acinetobacter . Мы благодарим I. Staes и J. Verwaeren за их помощь в разработке рисунков и статистики, соответственно. Финансирование: Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Фландрии (FWO) в рамках стратегического финансирования стипендии SB (1S32217N и 1S64718N) и «Krediet aan Navorsers» (FWOKAN2015002001). Вклад авторов: Х.Г., Дж. Л., Я. Б. и Р. Л. разработали эксперименты. H.G., D.Gr., R.L. и Y.B. разработан VersaTile. H.G. и D.Gr. сгенерированы все плитки. Х.Г. провела как просмотр, так и характеристику ведущего варианта. D.Gu. и А. провели ex vivo эксперименты с кожей свиньи. C.L., R.L. и V.-v.N. выполнили секвенирование и анализ нанопор. Х.Г., Д.Г., Ю.Б. написал газету. Все остальные авторы предоставили отзывы о рукописи. Конкурирующие интересы: Ю. выступал в качестве научного консультанта Lisando GmbH.H.G., D.Gr., R.L. и Y.B. являются изобретателями в патентной заявке, связанной с этой работой, поданной Гентским университетом и Левенским университетом (№ WO / 2018/114980, подана 19 февраля 2017 г., опубликована 28 июня 2018 г.). Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у соответствующего автора.Векторы VersaTile могут быть предоставлены Y.B. для академических исследований, ожидающих научной экспертизы, и заключенного соглашения о передаче материалов. Запросы на векторы VersaTile следует отправлять по адресу: yves.briers {at} ugent.be.

• Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Платформа вопросов и ответов Palantir для инвесторов открыта на все выходные перед отчетом о доходах во вторник

TipRanks

Goldman Sachs: эти 2 акции «сильной покупки» могут вырасти как минимум на 30%

Мы находимся в первом квартале Сейчас 2021 год, и сейчас хорошее время, чтобы подвести итоги того, что стоит за нами, и как это повлияет на то, что нас ждет впереди. Стратег Goldman Sachs Ян Хациус считает, что мы находимся на восходящей траектории, и впереди нас ждут лучшие времена. Хациус считает, что развитые экономики расширяются по мере отступления коронного кризиса. В США, в частности, он впечатлен «очень существенной фискальной поддержкой», предусмотренной в последнем пакете помощи в связи с COVID. Однако даже с учетом этого Хациус считает, что четвертый квартал был более слабым периодом, и мы все еще не совсем из него. Он оценивает рост в 1 квартале на уровне 5% и говорит, что мы увидим дальнейшее расширение, «сконцентрированное на весне», и «ускорение темпов роста до 10% во 2 квартале».«И под ускорением, Хациус означает, что инвесторы должны ожидать ВВП во втором квартале около 6,6%. Хациус связывает этот прогноз с продолжающимися программами вакцинации и продолжающейся разработкой вакцин против COVID. Вакцины Moderna и Pfizer уже находятся в производстве и обращении. Хациус говорит об этих программах: «Тот факт, что мы разрабатываем больше вариантов, и что у правительств по всему миру будет больше возможностей для выбора между различными вакцинами, [означает], что производство, вероятно, резко возрастет в ближайшие месяцы. … Это определенно основная причина нашего оптимистичного прогноза роста.«Помимо взгляда Хациуса на макроэкономическую ситуацию, аналитики Goldman Sachs также углубились в анализ конкретных акций. Используя базу данных TipRanks, мы определили две акции, которые, по прогнозам компании, продемонстрируют устойчивый рост в 2021 году. Остальная часть Стрит также поддерживает оба тикера, каждая из которых имеет консенсус-рейтинг «Сильная покупка». Stellantis (STLA) Мы уже говорили об автопроизводителях Детройта, и это правильно - они являются основными игроками на экономической арене США. Но у США нет монополии в автомобильном секторе, что доказала голландская компания Stellantis.Этот международный конгломерат является результатом слияния французской Groupe PSA и итало-американской Fiat-Chrysler. Сделка заключалась в соглашении о 50 на 50 акций, и Stellantis может похвастаться рыночной капитализацией, превышающей 50 миллиардов долларов, и портфелем почти легендарных табличек с именами, включая Alpha Romeo, Dodge Ram, Jeep и Maserati. Сделка, которая сформировала Stellantis, в настоящее время четвертого по величине производителя автомобилей в мире, заняла 16 месяцев после того, как о ней было впервые объявлено в октябре 2019 года. Теперь, когда это реальность - слияние было завершено в январе этого года - объединенная компания обещает затраты экономия почти 5 миллиардов евро на операциях Fiat-Chrysler и PSA.Эту экономию можно реализовать за счет повышения эффективности, а не за счет закрытия и сокращения производства. Stellantis - новинка на рынке, а тикер STLA вытеснил FCAU Fiat-Chrysler на Нью-Йоркской фондовой бирже, дав новой компании легендарную историю. Стоимость акций компании выросла почти втрое по сравнению с минимальной отметкой, достигнутой в марте прошлого года во время «коронной рецессии», и остается высокой после завершения слияния. Аналитик Goldman Sachs Джордж Галльерс оптимистично оценивает будущее Stellantis, написав: «Мы видим четыре движущих фактора, которые, на наш взгляд, позволят Stellantis работать. 1) Портфели продуктов PSA и FCA в Европе охватывают сегменты аналогичного размера по аналогичным ценам… 2) Дополнительная экономия от масштаба потенциально может оказать существенное влияние на обе компании ... 3) Обе компании находятся на относительно начальной стадии [в] электроэнергетике. автомобильные программы. Слияние предотвратит дублирование и обеспечит синергию. 4) Наконец, мы видим некоторые возможности вокруг центрального персонала, где существующие функции, вероятно, могут быть консолидированы ... »В соответствии с этим прогнозом Галлье оценивает STLA как« Покупать », а его целевая цена в 22 доллара указывает на возможность роста на 37% в предстоящем году.(Чтобы посмотреть послужной список Galliers, щелкните здесь) В целом это слияние вызвало много шума, и на Уолл-стрит широко распространено мнение о том, что объединенная компания принесет прибыль. STLA имеет консенсус-рейтинг «Сильная покупка», основанный на 7 единогласных обзорах покупателей. Акции оценены в 16,04 доллара, а средняя цель в 21,59 доллара совпадает с прогнозом Галлье, что предполагает потенциал роста на 34,5% в течение одного года. (См. Анализ запасов STLA на сайте TipRanks) NRG Energy (NRG) Из автомобилестроения мы переходим в энергетический сектор.NRG - поставщик коммунальных услуг с оборотом 10 миллиардов долларов с двумя головными офисами в Техасе и Нью-Джерси. Компания обеспечивает электроэнергией более 3 миллионов потребителей в 10 штатах и ​​округе Колумбия и может похвастаться генерирующей мощностью более 23 000 МВт, что делает ее одной из крупнейших электроэнергетических компаний Северной Америки. Производство NRG включает угольные, нефтяные и атомные электростанции, а также ветряные и солнечные фермы. В своем последнем квартальном отчете за 3 квартал 2020 года NRG показала общую выручку в размере 2,8 миллиарда долларов, а также 1,02 доллара на акцию на акцию. Несмотря на снижение по сравнению с прошлым годом, этого было более чем достаточно для поддержания стабильной и надежной выплаты дивидендов компании f 32.5 центов за обыкновенную акцию. Это составляет 1,30 доллара на обыкновенную акцию в годовом исчислении и дает доходность 3,1%. Аналитик Майкл Лапидес в своем обзоре акций Goldman Sachs оценивает NRG как "Покупать". Его целевая цена в 57 долларов предполагает потенциал роста на 36% от текущих уровней. (Чтобы посмотреть послужной список Лапидеса, щелкните здесь). Отмечая недавнее приобретение Direct Energy, Лапидес говорит, что он ожидает, что компания сократит долю заемных средств в ближайшем будущем. «После приобретения NRG компании Direct Energy, одного из крупнейших розничных продавцов электроэнергии и природного газа в США, мы считаем, что бизнес NRG несколько изменился.«Интегрированная бизнес-модель - владение оптовыми торговыми предприятиями по производству электроэнергии, которые поставляют электроэнергию, которая используется для обслуживания потребителей, поставляемых конкурентоспособным розничным подразделением NRG, - сокращает влияние торговых рынков электроэнергии и цен на сырьевые товары, одновременно увеличивая потенциал свободного денежного потока», - написал Лапидес. Мы рассматриваем 2021 год с точки зрения распределения капитала как год сокращения доли заемных средств, но с учетом того, что NRG будет генерировать почти 2 млрд долларов США в год в свободном денежном потоке, мы ожидаем роста выкупа акций, а также роста дивидендов на 8% в 2022–2023 годах. «Мы смотрим на еще одну акцию с консенсус-прогнозом аналитиков« Сильная покупка ». Эта оценка основана на соотношении 3: 1 между оценками« покупать »и« держать ». NRG торгуется по 41,84 доллара, а его средняя целевая цена в 52,75 доллара предполагает потенциал роста на 26%. (См. анализ акций NRG на сайте TipRanks). Чтобы найти хорошие идеи для торговли акциями по привлекательной оценке, посетите недавно выпущенный инструмент TipRanks «Лучшие акции для покупки», который объединяет все аналитические данные TipRanks по акциям. : Мнения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно упомянутым аналитикам.Контент предназначен для использования только в информационных целях. Прежде чем делать какие-либо инвестиции, очень важно провести собственный анализ.

Fiji: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений

Выбор подходящей платформы социальных сетей для вашего бизнеса

Когда вы заняты своим бизнесом, невозможно найти время, чтобы быть активным в каждой социальной сети. Ограничение вашего выбора до нескольких избранных платформ позволит вам сосредоточить свои усилия и получить максимальную отдачу от вложенного времени.

Так как же выбрать лучшую платформу для социальных сетей? Вот три шага, чтобы определить, какая платформа идеально подходит для вашего бизнеса.

Шаг 1. Определите свою аудиторию

Первый шаг - определить, кто ваша аудитория. Вы должны быть как можно более конкретными, так как это облегчит ваше решение. Запишите ответы на следующие вопросы:

• Кто ваш типичный покупатель?
• Сколько им лет?
• Они мужчины или женщины?
• Каков их доход и уровень образования?
• Что их интересует помимо ваших продуктов и услуг?

Используйте ответы на эти вопросы (и любые другие уместные вопросы, которые могут относиться к бизнесу или отрасли, в которой вы работаете), чтобы помочь создать профиль вашей аудитории.

Шаг 2. Определите свои цели

Как только вы узнаете свою аудиторию, вам нужно определить цели для этой аудитории. Как владелец бизнеса, ваша основная цель, вероятно, будет заключаться в стимулировании продаж за счет привлечения клиентов, но у социальных сетей есть и другие творческие цели. В то время как некоторые бренды используют социальные сети для повышения узнаваемости бренда и развития дружеских отношений с потенциальными покупателями, другие используют социальные сети для поддержки клиентов.

Например, медийная компания по запросу Netflix использует обработчик Twitter @Netflixhelps для решения проблем с обслуживанием клиентов.Это не только освобождает их телефонные линии, но и дает довольным клиентам возможность продвигать свой бренд.

Когда дело доходит до постановки целей в социальных сетях, составьте список как типичных, так и необычных способов, которыми социальные сети могут работать на ваш бренд.

Шаг 3. Найдите свою аудиторию

Теперь, когда у вас есть профиль вашей аудитории и определены ваши цели, пора найти свою аудиторию. Для этого вы собираетесь определить, какую платформу использует ваша аудитория, глядя на демографические данные пользователей на каждой платформе.Вы также захотите оценить, насколько активна ваша аудитория на этой платформе. Например, хотя у молодых пользователей Facebook могут быть профили, они более активны в Instagram.

Помимо демографических данных и вовлеченности, вы также захотите посмотреть, как люди используют платформу.

Ниже приводится руководство по некоторым основным платформам социальных сетей, которое поможет вам найти свою аудиторию.

Facebook

Facebook сообщает более 1.3 миллиарда пользователей - это больше, чем население Китая! Несмотря на весь этот шум, важно помнить, как люди используют Facebook: чтобы строить отношения и поддерживать контакты со старыми друзьями. Это делает Facebook хорошей платформой для повышения лояльности вашей существующей клиентской базы.

Обратной стороной Facebook является то, что может быть трудно привлечь новую аудиторию; из-за большого количества пользователей ваши сообщения имеют ограниченный охват даже в ваших собственных сетях.

Оценивая Facebook как потенциальную платформу, внимательно обдумывайте свои бизнес-цели. Если вы пытаетесь приобрести новый бизнес, Facebook может быть не лучшим вариантом, но если вы собираете постоянных подписчиков и вам нужен способ поддерживать с ними связь, это отличный вариант для вашего бизнеса.

Твиттер

Twitter - отличная платформа для повышения узнаваемости вашего бренда. Твиттер использует хэштег, который организует разговоры вокруг слова или фразы. Выполняя поиск по хэштегам, вы можете узнать, о чем говорят люди, чтобы вы могли создавать свои твиты, чтобы участвовать в популярных обсуждениях.Зачем тебе это делать? Поскольку Twitter может дать представление о том, какие темы актуальны, Twitter часто используется новостными агентствами для поиска статей.

Поскольку Twitter часто используется для предоставления аудитории обновлений в реальном времени, многие бренды сочетают Twitter с офлайн-взаимодействием, например с мероприятиями.

Pinterest

Pinterest используется для «скрапбукинга» или, другими словами, для сохранения контента путем «закрепления» фотографий на виртуальной доске объявлений. Пользователи-женщины доминируют в демографической группе Pinterest. Некоторые из наиболее распространенных булавок - это рецепты, идеи стиля, яркие фотографии и поделки своими руками.

Поскольку Pinterest - это платформа, основанная на визуализации, вам понадобится качественная графика для привлечения пользователей. Успешное использование Pinterest в бизнесе связано с высокими розничными продажами.

YouTube

Хотя YouTube насчитывает 1 миллиард пользователей, его охват намного превышает этот показатель. Вам не нужно регистрироваться, чтобы стать пользователем для просмотра контента на YouTube.

В результате YouTube стал одной из крупнейших платформ поисковых систем. Многие из этих запросов относятся к видео с инструкциями. Компании сферы услуг, которые могут предлагать этот тип контента, хорошо работают на этой платформе.

LinkedIn

LinkedIn отличается тем, что является наиболее используемой платформой для пожилых людей. Он может похвастаться наибольшим количеством пользователей в возрасте от 30 до 49 лет. LinkedIn уникален еще и тем, что имеет узкую направленность.Люди используют LinkedIn для поиска работы и профессионального общения. В результате платформа полезна для генерации лидов B2B, общего сетевого взаимодействия, а также для набора сотрудников.

Instagram

Instagram - одна из самых быстрорастущих платформ, особенно среди молодой аудитории. Как и Pinterest, Instagram использует фотографии для общения. В результате эта платформа действительно хорошо работает для визуальных предприятий, таких как искусство, еда, розничная торговля и красота.

Поскольку это развивающаяся платформа, здесь меньше шума, чем у Facebook. Это означает, что платформа полезна для привлечения потенциальных клиентов, потому что ваш охват шире.

Google+

Google+ известен пожилыми мужчинами. Эта платформа хорошо подходит для компаний, занимающихся программным обеспечением, проектированием и дизайном.

Поскольку платформа связана с поиском Google, она имеет больший вес в привлечении трафика на ваш сайт.Таким образом, вам следует подумать об использовании Google+, если вашей целью является поисковая оптимизация.

Платформа Knox для предприятий | Расширенное управление мобильной безопасностью

Доверенная среда с аппаратной поддержкой		Аппаратный корень доверия	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Уникальные аппаратные ключи устройства и одноразовые программируемые предохранители
		Повышение доверия	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	с аппаратной поддержкой
		Поддерживать доверие	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Защита ядра во время выполнения
		Подтвердите доверие	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Аппаратное обеспечение, идентификация устройства
Надежная защита данных	Данные в состоянии покоя	Аппаратная изоляция данных	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Частично поддерживается	Поддержка сторонних контейнеров, гранулярная конфигурация
		Шифрование на устройстве	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается
		Защита конфиденциальных данных	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Не поддерживается	Защита данных в состоянии покоя, даже когда устройство используется
	Данные в пути	Гибкие параметры VPN на устройстве	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Частично поддерживается	По запросу, двойное соединение, веб-защита через VPN, локальный обход
		Gov. -сертифицированный встроенный VPN-клиент	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Функции, сертифицированные государством
		Управление межсетевым экраном на устройстве	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Не поддерживается	Фильтрация на основе URL-адресов, управление для каждого приложения, журналы заблокированного доступа
Комплексное управление устройствами		Широкий выбор конфигураций устройств	Полностью поддерживается	Частично поддерживается (с добавлением дифференциации)	Частично поддерживается	Расширенные параметры аутентификации, настройка заставки при загрузке и т. Д.
		Расширенное управление мобильными приложениями	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается (с добавлением дифференциации)	Детальное управление приложениями без управляемого Google Play
		Ограничение функций устройства на уровне системы	Полностью поддерживается	Частично поддерживается (с добавлением дифференциации)	Частично поддерживается	Заводские настройки (режим восстановления), прошивка прошивки (режим загрузки)
Контроль и управление гранулированными устройствами		Углубленное использование устройства	Полностью поддерживается	Не поддерживается	Не поддерживается	Журналы аудита
		Углубленное использование сети	Полностью поддерживается	Не поддерживается	Не поддерживается	Аналитика сетевой платформы
		Оптимизированный пульт дистанционного управления	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Высокопроизводительное управление на уровне всего устройства; SECURE_FLAG заменяет
Универсальное управление учетными данными / сертификатами		Универсальное управление учетными данными	Полностью поддерживается	Не поддерживается	Не поддерживается	Настраиваемая блокировка клавиатуры / ODE
		Управление сертификатами клиентов на основе аппаратного обеспечения	Полностью поддерживается	Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Аппаратное обеспечение, широкий спектр поддержки CSR / CEP
Сертифицировано и пользуется доверием экспертов и государственных органов			Полностью поддерживается	Частично поддерживается	Частично поддерживается (с добавлением дифференциации)	Самые "сильные" оценки Gartner
Аппаратный корень доверия KPE Premium: полностью поддерживается Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Уникальные аппаратные ключи устройства и одноразовые программируемые предохранители Укрепление доверия KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Аппаратное обеспечение Поддерживать доверие KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Защита ядра во время выполнения Подтвердите доверие KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Аппаратное обеспечение, идентификация устройства
Данные в состоянии покоя Аппаратная изоляция данных KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: частично поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Поддержка сторонних контейнеров, гранулярная конфигурация Данные в состоянии покоя Шифрование на устройстве KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: полностью поддерживается Данные в состоянии покоя Защита конфиденциальных данных KPE Premium: полностью поддерживается Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: не поддерживается Спецификация КПЭ: Защита данных в состоянии покоя, даже когда устройство используется Данные в пути Гибкие параметры VPN на устройстве KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: частично поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: По запросу, двойное соединение, веб-защита через VPN, локальный обход Данные в пути Gov. -сертифицированный встроенный VPN-клиент KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Функции, сертифицированные государством Данные в пути Управление межсетевым экраном на устройстве KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: не поддерживается Спецификация КПЭ: Фильтрация на основе URL, управление каждым приложением, журналы заблокированного доступа
Широкий выбор конфигураций устройств KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: частично поддерживается (с добавлением дифференциации) Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Расширенные параметры аутентификации, настройка заставки при загрузке и т. Д. Расширенное управление мобильными приложениями KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Детальное управление приложениями без управляемого Google Play Ограничение функций устройства на уровне системы KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: частично поддерживается (с добавлением дифференциации) Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Заводские настройки (режим восстановления), прошивка прошивки (режим загрузки)
Углубленное использование устройства KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: не поддерживается Android Enterprise *: не поддерживается Спецификация КПЭ: Журналы аудита Углубленное использование сети KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: не поддерживается Android Enterprise *: не поддерживается Спецификация КПЭ: Аналитика сетевой платформы Оптимизированный пульт дистанционного управления KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Высокопроизводительное управление на уровне устройства; SECURE_FLAG заменяет
Универсальное управление учетными данными KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: не поддерживается Android Enterprise *: не поддерживается Спецификация КПЭ: Настраиваемая блокировка клавиатуры / ODE Управление сертификатами клиентов на основе аппаратного обеспечения KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: полностью поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Аппаратная поддержка, широкий спектр поддержки CSR / CEP
KPE Premium: Полная поддержка Стандарт КПЭ: частично поддерживается Android Enterprise *: частично поддерживается Спецификация КПЭ: Самые "сильные" оценки Gartner